31973L0046

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VIERTE RICHTLINIE DER KOMMISSION

vom 5 . Dezember 1972

zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

( 73/46/EWG )

DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft ,

gestützt auf die Richtlinie des Rates vom 20 . Juli 1970 über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ( 1 ) in der Fassung der Richtlinie vom 20 . Juli 1972 ( 2 ) , insbesondere auf Artikel 2 ,

in Erwägung nachstehender Gründe :

Die obengenannte Richtlinie bestimmt , daß die amtlichen Untersuchungen von Futtermitteln zur Feststellung , ob die auf Grund der Rechts - oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungen hinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel erfuellt sind , nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analysemethoden durchgeführt werden .

Die Richtlinien Nr . 71/250/EWG , Nr . 71/393/EWG und Nr . 72/199/EWG der Kommission vom 15 . Juni 1971 ( 3 ) , vom 18 . November 1971 ( 4 ) und vom 27 . April 1972 ( 5 ) haben bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt . Der Stand der seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr , eine vierte Serie von Analysemethoden festzulegen .

Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses -

HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN :

Artikel 1

Die Mitgliedstaaten schreiben vor , daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf den Gehalt an Feuchtigkeit in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen sowie auf den Gehalt an Magnesium und Rohfaser in Futtermitteln nach den in Anlage I zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden .

Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 ( Einführung ) der Anlage zur Ersten Richtlinie Nr . 71/250/EWG der Kommission vom 15 . Juni 1971 finden für die in Anlage I zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden Anwendung .

Artikel 2

Die Mitgliedstaaten schreiben vor , daß die Analysen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Retinol ( Vitamin A ) , Thiamin ( Aneurin , Vitamin B1 ) sowie Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure ( Vitamin C ) nach den in Anlage II zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden .

Die allgemeinen Bestimmungen des Teils 1 ( Einführung ) der Anlage zur Ersten Richtlinie Nr . 71/250/EWG der Kommission vom 15 . Juni 1971 , mit Ausnahme des die Vorbereitung der Analyseprobe betreffenden Teils , finden für die in Anlage II zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden Anwendung .

Artikel 3

Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1 . Januar 1974 die erforderlichen Rechts - oder Verwaltungsvorschriften in Kraft , um den Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen . Sie setzen die Kommission unverzueglich hiervon in Kenntnis .

Artikel 4

Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet .

Brüssel , den 5 . Dezember 1972

Für die Kommission

Der Präsident

S . L . MANSHOLT

( 1 ) ABl . Nr . L 170 vom 3 . 8 . 1970 , S . 2 .

( 2 ) ABl . Nr . L 171 vom 29 . 7 . 1972 , S . 39 .

( 3 ) ABl . Nr . L 155 vom 12 . 7 . 1971 , S . 13 .

( 4 ) ABl . Nr . L 279 vom 20 . 12 . 1971 , S . 7 .

( 5 ) ABl . Nr . L 123 vom 29 . 5 . 1972 , S . 6 .

ANLAGE I

1 . BESTIMMUNG VON FEUCHTIGKEIT IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Feuchtigkeit ( Wasser und andere fluechtige Bestandteile ) und an fluechtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen .

2 . Prinzip

Die Probe wird bei 103 * C getrocknet , bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt . Der Gewichtsverlust wird bestimmt .

3 . Geräte

3.1 . Schale mit flachem Boden , aus korrosionsbeständigem Material , Durchmesser : 8 - 9 cm , Höhe ca . 3 cm

3.2 . Quecksilber-Thermometer , mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende , von ca . 80 * C bis mindestens 110 * C graduiert , Länge ca . 10 cm

3.3 . Sandbad oder elektrische Heizplatte

3.4 . Exsikkator , der ein wirksames Trocknungsmittel enthält

3.5 . Analysenwaage .

4 . Ausführung

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene tarierte Schale ( 3.1 ) , die das Thermometer ( 3.2 ) enthält , eingewogen und auf dem Sandbad bzw . der Heizplatte ( 3.3 ) so erhitzt , daß bei stetigem Umrühren mit dem Thermometer nach ca . 7 Min . eine Temperatur von 90 * C erreicht wird .

Entsprechend der Häufigkeit , mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen , wird die Heizintensität verringert . Die Temperatur darf 105 * C nicht überschreiten . Das Umrühren wird unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale bis zum Ende der Blasenbildung fortgesetzt .

Um sicherzustellen , daß die Feuchtigkeit völlig entfernt wird , ist das Erhitzen mehrmals bei 103 * C mehr oder weniger 2 * C zu wiederholen , wobei man zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen auf 93 * C abkühlen lässt . Dann lässt man bis zur Raumtemperatur im Exsikkator ( 3.4 ) abkühlen und wägt . Dieses Verfahren ist zu wiederholen , bis der Gewichtsverlust zwischen zwei aufeinandenfolgenden Wägungen 2 mg nicht überschreitet .

NB : Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt eine Oxydation des Fettes an . In diesem Fall legt man der Berechnung das Ergebnis der Wägung zugrunde , die kurz vor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgeführt wurde .

5 . Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Feuchtigkeit der Probe in v.H . wird durch folgende Formel wiedergegeben :

( M1 - M2 ) * 100/M0

M0 = Gewicht der Probe in g ,

M1 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzen ,

M2 = Gewicht der Schale mit Inhalt ing g nach dem Erhitzen .

Ergebnisse unter 0,05 v.H . sollten mit der Bezeichnung " weniger als 0,05 v.H . " angegeben werden .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen 2 Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 0,05 v.H . absolut nicht überschreiten .

2 . BESTIMMUNG VON MAGNESIUM

- durch Atomabsorptions-Spektrophotometrie -

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Magnesium in Futtermitteln . Sie eignet sich besonders zur Bestimmung von Magnesiumgehalten unter 5 v.H .

2 . Prinzip

Die Probe wird verascht und in verdünnter Salzsäure gelöst . Wenn die Probe keine organischen Bestandteile enthält , wird sie unmittelbar in verdünnter Salzsäure gelöst . Die Lösung wird verdünnt und der Magnesiumgehalt durch Atomabsorptions-Spektrophotomctrie bei 285,2 nm im Vergleich zu Eichlösungen bestimmt .

3 . Reagenzien

3.1 . Salzsäure p.a . , D : 1,16

3.2 . Salzsäure p.a . , D : 1,19

3.3 . Magnesiumband oder -draht , oder Magnesiumsulfat ( MgSO4 * 7 H2O ) p.a . vakuumgetrocknet bei Raumtemperatur

3.4 . Strontiumsalzlösung ( Chlorid oder Nitrat ) 2,5 v.H . ( G/V ) Strontium ( = 76,08 g SrCl2 * 6 H2O p.a./1 oder 60,38 g Sr(NO3)2 p.a./1 )

3.5 . Magnesium-Standardlösung : 1 g Magnesium ( 3.3 ) , das zuvor sorgfältig von seinem Oxidfilm befreit wurde , oder eine entsprechende Menge Magnesiumsulfat ( 3.3 ) wird auf 1 mg genau abgewogen und in einn 1 000-ml-Meßkolben gebracht ; dann werden 80 ml Salzsäure ( 3.1 ) hinzugefügt , nach Auflösen des Magnesiums wird auf 1 000 ml mit Wasser aufgefuellt . 1 ml dieser Lösung enthält 1,000 mg Magnesium .

4 . Geräte

4.1 . Veraschungsschalen aus Platin , Quarz oder Porzellan

4.2 . Elektrischer Muffelofen mit Thermostat

4.3 . Atomabsorptions-Spektrophotometer .

5 . Ausführung

5.1 . Herstellung der Analysenlösung

5.1.1 . Futtermittel , die ausschließlich aus anorganischen Bestandteilen bestehen

5 g der Probe , auf ein mg genau gewogen , werden mit 250 - 300 ml Wasser in einen 500-ml-Meßkolben gebracht . Man fügt 40 ml Salzsäure ( 3.1 ) hinzu und hält etwa 30 Min . in leichtem Sieden . Nach dem Abkühlen wird mit Wasser zur Marke aufgefuellt , gemischt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein trockenes Becherglas filtriert . Der erste Anteil des Filtrats von etwa 30 ml wird verworfen .

Bei Anwesenheit von Kieselsäure werden 5 g der Probe mit einer ausreichenden Menge ( 15 - 30 ml ) Salzsäure ( 3.2 ) auf einem Wasserbad zur Trockne eingedampft . Die weitere Behandlung erfolgt wie unter 5.1.2 ab 3 . Satz beschrieben .

5.1.2 . Futtermittel , die überwiegend aus anorganischen Bestandteilen bestehen

5 g der Probe , auf 1 mg genau gewogen , werden bei 550 * C im Muffelofen verascht , bis die Asche keine Kohleteilchen enthält . Zur * oscheidung von Kieselsäure wird die Asche mit einer ausreichenden Menge ( 15 - 30 ml ) Salzsäure ( 3.2 ) versetzt und auf dem Wasserbad zur Trockne eingedampft . Anschließend erhitzt man 1 Std . im Trockenschrank bei 105 * C . Der Rückstand wird mit 10 ml Salzsäure ( 3.1 ) aufgenommen und mit heissem Wasser in einen 500-ml-Meßkolben übergespült . Es wird kurz aufgekocht und nach dem Abkühlen mit Wasser zur Marke aufgefuellt , umgeschüttelt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein trockenes Becherglas filtriert . Der erste Anteil des Filtrats von etwa 30 ml wird verworfen .

5.1.3 . Futtermittel , die überwiegend aus organischen Bestandteilen bestehen

5 g der Probe werden auf 1 mg genau in eine Veraschungsschale eingewogen und bei 550 * C im Muffelofen verascht , bis die Asche keine Kohleteilchen enthält . Die Asche wird mit 5 ml Salzsäure ( 3.2 ) übergossen und auf dem Wasserbad zur Trockne eingedampft und hierauf 1 Std . bei 105 * C in einem Trockenschrank getrocknet , um die Kieselsäure unlöslich zu machen . Hierauf wird der Rückstand mit 5 ml Salzsäure ( 3.1 ) aufgenommen und mit heissem Wasser in einen 250-ml-Meßkolben übergespült , kurz aufgekocht und nach dem Abkühlen mit Wasser zur Marke aufgefuellt , gemischt und durch ein trockenes Faltenfilter in trockene Bechergläser filtriert . Der erste Anteil des Filtrats von etwa 30 ml wird verworfen .

5.2 . Messung der Atomabsorption

Aus der Magnesium-Standardlösung ( 3.5 ) werden durch Verdünnen mit Wasser mindestens 5 Eichlösungen steigender Konzentrationen hergestellt , entsprechend dem optimalen Meßbereich des Atomabsorptions-Spektrophotometers . Jeder Eichlösung werden 10 ml Strontiumsalzlösung ( 3.4 ) zugesetzt , bevor mit Wasser zu einem Volumen von 100 ml aufgefuellt wird .

Ein aliquoter Teil des nach 5.1.1 , 5.1.2 oder 5.1.3 gewonnenen Filtrats wird mit Wasser so verdünnt , daß man eine Magnesiumkonzentration erhält , die im Konzentrationsbereich der Eichlösungen liegt . Die Salzsäurekonzentration dieser Lösung darf 0,4 N nicht überschreiten . Vor dem Auffuellen auf ein Volumen von 100 ml werden 10 ml Strontiumsalzlösung ( 3.4 ) hinzugefügt .

Die Messung der Atomabsorption erfolgt bei der Analysenlösung und den Eichlösungen bei einer Wellenlänge von 285,2 nm .

6 . Berechnung der Ergebnisse

Der Magnesiumgehalt der Probe ist mit Hilfe der Eichlösungen zu berechnen . Das Ergebnis ist in v.H . der Probe auszudrücken .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen 2 Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe 5 v.H . relativ nicht überschreiten .

3 . BESTIMMUNG VON ROHFASER

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlanbt die Bestimmung des Gehalts an säure - und alkaliunlöslichen fettfreien organischen Bestandteilen in Futtermitteln , konventionell ausgedrückt als Rohfaser .

2 . Prinzip

Die gegebenenfalls entfettete Probe wird nacheinander mit kochender Schwefelsäure und mit kochender Kaliumhydroxidlösung bestimmter Konzentrationen behandelt . Der Rückstand wird durch Filtration über Asbest abgetrennt , gewaschen , getrocknet , gewogen und bei 900 * C verascht . Der Gewichtsverlust bei dieser Veraschung entspricht der Rohfaser der Einwaage .

3 . Reagenzien

3.1 . 0,26 N Schwefelsäure

3.2 . Behandelter Asbests Asbest für Gooch-Tiegel wird mit etwa dem 5fachen Gewicht an verdunnter Salzsäure ( 1 Vol . Salzsäure , D : 1,19 + 3 Vol . Wasser ) versetzt . Man kocht die Mischung etwa 45 Min . lang , lässt abkühlen und filtriert durch einen Büchner-Trichter . Der Rückstand wird mit Wasser gewaschen , bis das letzte Waschwasser völlig frei von Säure ist , anschließend wird mit Aceton ( 3.6 ) nachgewaschen . Der Asbest wird im Trockenschrank getrocknet , anschließend 2 Std . bei 900 * C geglüht und nach dem Abkühlen in einem geschlossenen Gefäß aufbewahrt . Der so behandelte Asbest kann mehrfach verwendet werden . Er muß den Anforderungen entsprechen , die bei 5.1 im Blindversuch genannt sind .

3.3 . Antischaummittel ( z.B . Silikon )

3.4 . 0,23 N Kaliumhydroxidlösung

3.5 . 0,5 N Salzsäure

3.6 . Aceton , rein

3.7 . Diäthyläther , rein .

4 . Geräte

4.1 . Bechergläser , mindestens 600 ml Inhalt , mit Marke bei 200 ml

4.2 . Porzellanplatten , Durchmesser : ca . 80 mm , Dicke : ca . 4 mm , mit ungefähr 32 Löchern von je ca . 4 mm Durchmesser

4.3 . Saugflaschen mit durchbohrtem Gummistopfen , ca . 2 l Inhalt , mit Marke bei 800 ml und mit einem Glastrichter von 120 mm Durchmesser versehen

4.4 . Filterplatten , Durchmesser : ca . 40 mm , Dicke : ca . 4 mm , Rand konisch dem Trichter angepasst ( 4.3 ) , mit ca . 16 Löchern von je ca . 4 mm Durchmesser , mit einem Drahtgeflecht bedeckt , das eine Maschenweite von ca . 1 mm besitzt . Filterplatten und Drahtgeflecht müssen beständig gegen Säure und Lauge sein

4.5 . Veraschungsschalen aus Platin oder Quarz

4.6 . Elektrischer Muffelofen mit Thermostat

4.7 . Exsikkator

4.8 . Vorbereitung des Asbestfilters

2,0 g behandelter Asbest ( 3.2 ) werden in 100 ml Wasser aufgeschwemmt . Unter Anwendung von Vakuum wird über eine Filterplatte , welche mit einem Drahtgeflecht ( 4.4 ) bedeckt und in den Trichter einer Saugflasche ( 4.3 ) gelegt wurde , abgesaugt . Das Filtrat wird aufgefangen und nochmals über denselben Filter filtriert . Das letzte Filtrat wird verworfen .

5 . Ausführung

3 g der Probe werden auf 1 mg genau eingewogen und mit 2 g behandelten Asbests ( 3.2 ) in ein Becherglas ( 4.1 ) gebracht . 200 ml Schwefelsäure ( 3.1 ) und einige Tropfen Antischaummittel ( 3.3 ) werden hinzugegeben . Es wird schnell zum Sieden erhitzt und genau 30 Min . gekocht . Um das Volumen konstant zu halten , wird das Becherglas mit einem Kühlsystem bedeckt , z.B . mit einem 500-ml-Rundkolben , durch den Kühlwasser geleitet wird . Das Kochen wird unterbrochen , indem etwa 50 ml kaltes Wasser hinzugefügt werden , und es wird sogleich unter Anwendung von Vakuum durch ein Asbestfilter filtriert , welches vorher wie unter 4.8 beschrieben vorbereitet wird .

Der Rückstand wird fünfmal mit je etwa 100 ml heissem Wasser gewaschen , so daß das Endvolumen des Filtrats ca . 800 ml beträgt . Anschließend wird der Rückstand quantitativ in das Becherglas ( 4.1 ) zurückgegeben , in das vorher eine Porzellanplatte ( 4.2 ) zur Vermeidung eines Siedeverzugs gelegt wurde . 200 ml Kaliumhydroxidlösung ( 3.4 ) werden hinzugefügt , es wird schnell zum Sieden erhitzt und genau 30 Min . gekocht . Nach dem sofortigen Zusatz von etwa 50 ml kaltem Wasser wird unter Anwendung von Vakuum durch einen neuen Asbestfilter filtriert , welcher vorher wie unter 4.8 beschrieben vorbereitet wurde . Der Rückstand wird mit heissem Wasser bis zur neutralen Reaktion der letzten Waschfluessigkeit ( Prüfung mit Lackmuspapier ) und danach dreimal mit Aceton ( 3.6 ) gewaschen ( zusammen etwa 100 ml Aceton ) .

Der Rückstand wird quantitativ in eine Veraschungsschale ( 4.5 ) übergeführt - wenn erforderlich - , aufgelockert und im Trockenschrank bei 130 * C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und nach dem Abkühlen im Exsikkator schnell gewogen . Die Schale mit Inhalt wird nunmehr in dem Muffelofen ( 4.6 ) bei 900 * C 30 Min . geglüht . Nach dem Abkühlen im Exsikkator wird schnell gewogen .

Ein Blindversuch wird nach demselben Verfahren in Abwesenheit der Analysenprobe mit behandeltem Asbest ( 3.2 ) durchgeführt . Der Gewichtsverlust nach dem Glühen von 6 g Asbest darf nicht mehr als 10 mg betragen .

6 . Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Rohfaser in Hundertteilen der Probe wird mit Hilfe folgender Formel berechnet :

( a - b ) * 100/3

wobei

a = Glühverlust beim Hauptversuch ,

b = Glühverlust beim Blindversuch .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen 2 Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe bei Gehalten von weniger als 10 v.H . Rohfaser 0,3 absolut und bei Gehalten von 10 v.H . Rohfaser und mehr 3 v.H . relativ nicht überschreiten .

7 . Bemerkungen

7.1 . Futtermittel , die mehr als 10 v.H . Fett enthalten , werden vor der Analyse mit Diäthyläther entfettet . Hierzu wird die Probe ( 3 g auf 1 mg genau eingewogen ) auf einen wie unter 4.8 beschriebenen Asbestfilter gebracht und dreimal mit je ca . 50 ml Diäthyläther ( 3.7 ) überschichtet . Der Diäthyläther wird unter Anwendung von Vakuum jedesmal vorsichtig abgesaugt . Die entfettete Probe und der Asbest werden dann quantitativ in ein Becherglas ( 4.1 ) gebracht , und die Analyse wird nach 5 fortgesetzt .

7.2 . Futtermittel , die nicht direkt extrahierbare Fette enthalten , müssen wie unter 7.1 beschrieben entfettet und zusätzlich nach dem Auswaschen des Rückstands der Säurehydrolyse einer erneuten Entfettung unterworfen werden . Dazu wird der Rückstand der Säurehydrolyse dreimal mit Aceton ( 3.6 ) ( zusammen 100 ml ) und anschließend dreimal mit je 50 ml Diäthyläther ( 3.7 ) gewaschen . Danach wird der Rückstand quantitativ in ein Becherglas ( 4.1 ) übergeführt und die Analyse wie unter 5 2 . Absatz fortgeführt ( Behandlung mit Kaliumhydroxidlösung ) .

7.3 . Bei Futtermitteln mit einem hohen Gehalt an Calcium ( über 2 v.H . Ca ) wird die Einwaage ( 3 g auf 1 mg genau abgewogen ) 5 Min . lang mit 100 ml kalter 0,5 N Salzsäure ( 3,5 ) in einem Becherglas ( 4.1 ) vorbehandelt . Es wird sofort filtriert und mit kaltem Wasser ausgewaschen . Dabei dienen die für die Schwefelsäurekochung vorgesehenen 2,0 g Asbest als Filtrierhilfsmittel . Falls Schwierigkeiten bei der Filtration auftreten , wird die Salzsäureaufschwemmung mit Aceton verdünnt . Dann wird weiter wie bei 5 verfahren .

ANLAGE II

1 . BESTIMMUNG VON RETINOL ( VITAMIN A )

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Rentinol ( Vitamin A ) in Futtermitteln , Konzentraten und Vormischungen . Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 10 000 IE/kg für stark pigmentierte Futtermittel und 4 000 IE/kg für alle anderen Produkte ( 1 ) . Je nach dem zu erwartenden Gehalt an Retinol sind die Erzeugnisse in zwei Gruppen zu unterteilen :

Gruppe A : Gehalte von weniger als 200 000 IE/kg ,

Gruppe B : Gehalte von 200 000 IE/kg und mehr .

2 . Prinzip

Die Probe wird in Gegenwart eines Antioxidans oder unter Stickstoff-Atmosphäre mit einer Kaliumhydroxidlösung unter Zusatz von Äthanol heiß hydrolysiert . Die Mischung wird mit 1,2-Dichloräthan extrahiert , der Extrakt wird zur Trockne eingedampft und mit Petroläther aufgenommen . Die Lösung wird über eine Aluminiumoxid-Säule chromatographiert ( bei Erzeugnissen der Gruppe B wird nur in bestimmten Fällen chromatographiert ) . Die Bestimmung von Retinol erfolgt bei Erzeugnissen der Gruppe A durch photometrische Auswertung bei 610 nm nach Entwicklung eines Farbkomplexes gemäß der Carr-Price-Reaktion , bei Erzeugnissen der Gruppe B durch UV-spektrophotometrische Auswertung bei 325 nm .

3 . Reagenzien

a ) zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A und B

3.1 . Äthanol , 96 v.H . ( V/V )

3.2 . Natriumascorbatlösung 10 v.H . ( G/V ) p.a . oder

3.3 . Stickstoff , gereinigt

3.4 . Kaliumhydroxidlösung 50 v.H . ( G/V ) p.a .

3.5 . 1 N Kaliumhydroxidlösung

3.6 . 0,5 N Kaliumhydroxidlösung

3.7 . 1,2-Dichloräthan p.a .

3.8 . Petroläther , reinst , Siedeintervall 30 - 50 * C . Wenn erforderlich , wie folgt reinigen : 1 000 ml Petroläther werden mit 20-ml-Portionen konzentrierter Schwefelsäure so lange geschüttelt , bis letztere farblos bleibt . Dann wird die Säure entfernt und der Petroläther einmal mit 500 ml Wasser , zweimal mit 250 ml einer 10 v.H . Natriumhydroxidlösung und dreimal mit je 500 ml Wasser nacheinander gewaschen . Man trennt von der wäßrigen Schicht ab , trocknet während ca . 1 Std . über Aktivkohle und wasserfreiem Natriumsulfat , filtriert und destilliert .

3.9 . Aluminiumoxid zur Chromatographie , standardisiert nach Brockmann . Es wird 8 Std . lang bei 750 * C erhitzt , im Exsikkator abgekühlt und in braunen Schliffflaschen aufbewahrt . Vor der weiteren Verwendung zur Chromatographie wird wie folgt angefeuchtet : 10 g Aluminiumoxid und 0,7 ml Wasser werden in eine braune Flasche gegeben , die Flasche wird hermetisch geschlossen , 5 Min . lang im siedenden Wasserbad kräftig geschüttelt und abkühlen gelassen . Die Aktivität des vorbereiteten Aluminiumoxids wird durch Analyse einer bekannten Menge ( 500 IE ) Retinol nach 5.3 und 5.4 überprüft .

3.10 . Aluminiumoxid basisch , Aktivität I

3.11 . Diäthyläther , reinst . Zur Entfernung von Peroxiden und Wasserspuren auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule ( 3.10 ) gereinigt ( 25 g Aluminiumoxid für etwa 250 ml Diäthyläther )

3.12 . Petroläthermischungen ( 3.8 ) mit 4 , 8 , 12 , 16 und 20 v.H . ( V/V )-Diäthyläther ( 3.11 )

3.13 . Natriumsulfidlösung , aus Natriumsulfid p.a . , 0,5 Mol in 70 v.H . ( V/V ) Glycerin

b ) nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A

3.14 . Benzol p.a . , kristallisierbar

3.15 . Chloroform p.a . Zur Entfernung von Äthanol , Phosgen und Wasserspuren wird auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule ( 3.10 ) gereinigt ( 50 g Aluminiumoxid für etwa 200 ml Chloroform ; es empfiehlt sich , die ersten 50 ml des Eluats nochmals über dieselbe Säule zu reinigen )

3.16 . Carr-Price-Reagenz : ca . 25 g Antimontrichlorid p.a . ( im Exsikkatot aufbewahrt ) werden mit 100 ml Chloroform ( 3.15 ) bis zur Sättigung der Lösung geschüttelt . Ein kleiner Bodensatz von Antimontrichlorid-Kristallen stört nicht . 2 ml Essigsäureanhydrid p.a . werden hinzugegeben und das Reagenz in brauner Schliffstopfenflasche im Eisschrank aufbewahrt . Es ist mehrere Wochen haltbar .

3.17 . Retinol-Standard , spektrophotometrisch geprüft

c ) nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe B

3.18 . Isopropanol , zur Chromatographie .

4 . Geräte

4.1 . Wasserbad

4.2 . Vakuum-Rotations-Verdampfer mit Rundkolben von verschiedenem Inhalt

4.3 . Chromatographieröhre aus Glas ( Länge : 300 mm , innerer Durchmesser : ca . 13 mm )

4.4 . Spektralphotometer mit Kuevetten von 10 mm Schichtdicke ( aus Quarz für die Messung im UV-Bereich )

4.5 . UV-Lampe , 365 mm .

5 . Ausführung

NB . : Alle Arbeiten werden bei gedämpftem Tageslicht , gegebenenfalls unter Verwendung von braunen Glasgefässen , durchgeführt .

5.1 . Einwaage

Je nach dem vermuteten Gehalt an Retinol wird eine Menge der fein zerkleinerten Probe wie folgt eingewogen : bei Konzentraten ( Gehalte über 20 000 IE/g ) : 0,1 bis 1,0 g ; bei Vormischungen ( Gehalte zwischen 400 und 20 000 IE/g ) : 3,0 bis 5,0 g ;

bei Mineralmischungen : 10 bis 20 g ;

bei Erzeugnissen der Gruppe A : 30 g .

Die Einwaage wird sofort in einen 500-ml-Rundschliffkolben umgefuellt .

5.2 . Hydrolyse und Extraktion ( 2 )

40 ml Äthanol ( 3.1 ) , 2 ml Natriumascorbatlösung ( 3.2 ) ( 3 ) , 10 ml Kaliumhydroxidlösung ( 3.4 ) und 2 ml Natriumsulfidlösung ( 3.13 ) werden nacheinander der eingewogenen Probe zugegeben .

Die Mischung wird bei 70 - 80 * C 30 Min . lang am Rückflußkühler erhitzt und anschließend unter fließendem Wasser abgekühlt . Darauf werden 50 ml Äthanol ( 3.1 ) und exakt mit einer Pipette 100 ml 1,2-Dichloräthan ( 3.7 ) zugegeben . Die Mischung wird kräftig durchgeschüttelt und die überstehende Flüssigkeit in einen Scheidetrichter dekantiert . Man gibt 150 ml Kaliumhydroxidlösung ( 3.5 ) zu , schüttelt während 10 Sek . und wartet die Schichtentrennung ab . Die Dichloräthanphase ( Unterschicht ) wird in einen Scheidetrichter abgelassen , man gibt 40 ml Kaliumhydroxidlösung ( 3.6 ) zu , schüttelt während 10 Sek . und wartet die Schichtentrennung ab . Die Dichloräthanphase wird in einen Scheidetrichter abgelassen und dann 6 - bis 8mal mit 40-ml-Portionen Wasser bis zur Alkalifreiheit ( Phenolphthaleinprobe ) gewaschen . Die Dichloräthanphase wird aufgefangen und die Wasserspuren werden mit Filterpapierschnitzeln entfernt .

Ein aliquoter Teil der Dichloräthanlösung wird bei 40 * C Wassertemperatur im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand schnell in 5 ml Petroläther ( 3.8 ) aufgenommen .

Bei Erzeugnissen der Gruppe A wird , wie unter 5.3.1 angegeben , chromatographiert .

Bei Erzeugnissen der Gruppe B wird die Lösung in einen 50-ml-Meßkolben gegeben , mit Petroläther ( 3.8 ) zur Marke aufgefuellt und gemischt . Dann wird die Extinktion wie unter 5.4.2 angegeben gemessen .

5.3 . Chromatographie

5.3.1 . Erzeugnisse der Gruppe A

Ein Chromatographierohr ( 4.3 ) wird bis zu einer Höhe von 200 mm mit Aluminiumoxid ( 3.9 ) , welches mit Petroläther ( 3.8 ) befeuchtet wurde , gefuellt . Die unter 5.2 erhaltene Lösung wird auf die Säule gegeben , dann werden sofort 20 ml Petroläther ( 3.8 ) hinzugefügt . Anschließend wird das Chromatogramm nacheinander mit je 10-ml-Portionen der Petroläthermischungen mit 4 , 8 , 12 , 16 und 20 v.H . Diäthyläther ( 3.12 ) , unter schwachem Vakuum oder auch Überdruck eluiert . Die Tropfgeschwindigkeit wird auf 2 bis 3 Tropfen/Sek . einreguliert .

Die Carotin-Fraktion wird im Durchlaufchromatogramm zuerst erhalten ( 4 ) . Die Retinol-Fraktion steigt im allgemeinen mit der 20 v.H . Diäthyläther-Petroläthermischung ( 3.12 ) ab . Die Elution wird im UV-Licht ( kurzes Beleuchten mit einer Hg-Lampe ) kontrolliert . Der fluoreszierende Retinol-Horizont trennt sich dabei deutlich von den nachfolgenden gelb gefärbten Xanthophyllbändern . Die Retinol-Fraktion des Eluats wird in einer Vorlage aufgefangen .

5.3.2 . Erzeugnisse der Gruppe B

Die Chromatographie muß nur durchgeführt werden , wenn die Messungen der unter 5.4.2 erwähnten Extinktion nicht nach 5.4.2 vorschriftsmässig sind .

Wenn die Chromatographie erforderlich ist , wird ein aliquoter Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung , der etwa 500 IE Retinol enthält , auf die Chromatographiesäule gegeben . Die Chromatographie wird wie unter 5.3.1 beschrieben fortgeführt .

5.4 . Messung der Extinktion

5.4.1 . Erzeugnisse der Gruppe A

Das unter 5.3.1 erhaltene Retinol-Eluat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und in 2 ml Benzol ( 3.14 ) aufgenommen . 0,3 ml davon werden mit 3 ml Carr-Price-Reagenz ( 3.16 ) versetzt . Es entwickelt sich eine blaue Färbung , deren Extinktion im Spektralphotometer bei 610 nm , genau 30 Sek . nach Reaktionsbeginn , gemessen wird . Die Berechnung des Vitamin-A-Gehalts erfolgt über eine Eichkurve , die mit Benzollösungen von Retinol-Standard in steigenden Konzentrationen unter Zugabe von Carr-Price-Reagenz ( 2 bis 16 ) IE Retinol-Standard ( 3.17 ) pro 0,3 ml Benzol ( 3.14 ) + 3 ml Carr-Price-Reagenz ( 3.16 ) aufgestellt wird . Die Eichkurve ist mit dem Standard und dem frisch bereiteten Carr-Price-Reagenz regelmässig und in kurzen Zeitabständen zu überprüfen .

5.4.2 . Erzeugnisse der Gruppe B

Ein aliquoter Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung , der etwa 200 IE Retinol enthält , wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und in 25 ml Isopropanol ( 3.18 ) aufgenommen . Die Extinktion wird im Spektralphotometer bei 325 , 310 und 334 nm gemessen . Das Absorptionsmaximum liegt bei 325 nm . Der Retinol-Gehalt der Lösung berechnet sich aus :

E325 * 18,30 = IE Retinol/ml

Das Verhältnis der Extinktionen

E310 : E325 und E334 : E325

muß jedoch den Wert 6 : 7 = 0,857 erreichen .

Weicht eines dieser Verhältnisse stärker ab ( < 0,830 oder > 0,880 ) , muß der Messung der Extinktionen eine Chromatographie nach dem Verfahren 5.3.2 vorausgehen .

Zeigt die nach der Chromatographie vorgenommene Messung der Extinktionen an , daß die obengenannten Verhältnisse immer noch vom Wert 0,857 stärker abweichen ( < 0,830 oder > 0,880 ) , dann ist die Bestimmung nach dem für die Erzeugnisse der Gruppe A vorgeschriebenen Verfahren durchzuführen .

6 . Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Retinol der Probe wird unter Berücksichtigung des Gewichts der Einwaage und der Verdünnungsverhältnisse im Analysengang berechnet . Die Ergebnisse werden in IE Retinol pro kg ausgedrückt .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe

- bei Gehalten von weniger als 75 000 IE/kg 20 v.H . relativ ,

- bei Gehalten von 75 000 bis 150 000 IE/kg 15 000 IE absolut ,

- bei Gehalten von 150 000 bis 250 000 IE/kg 10 v.H . relativ ,

- bei Gehalten von 250 000 bis 500 000 IE/kg 25 000 IE absolut ,

- bei Gehalten von mehr als 500 000 IE/kg 5 v.H . relativ

nicht überschreiten .

2 . BESTIMMUNG VON THIAMIN ( ANEURIN , VITAMIN B1 )

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung von Thiamin ( Aneurin , Vitamin B1 ) in Futtermitteln , Konzentraten und Vormischungen . Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 5 mg/kg .

2 . Prinzip

Die Probe wird mit verdünnter Schwefelsäure heiß behandelt und enzymatisch hydrolysiert . Die Lösung wird alkalisch oxydiert , und das erhaltene Thiochrom wird mit Isobutanol extrahiert und fluorinetrisch bestimmt .

3 . Reagenzien

3.1 . Thiamin-Standardlösung 100 mg/ml : 112,3 mg reinstes , im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknetes Thiaminhydrochlorid werden in 1 000 ml 0,2 N Schwefelsäure ( 3.2 ) gelöst . Kühl und dunkel aufbewahrt hält sich diese Lösung einen Monat .

3.2 . 0,2 N Schwefelsäure

3.3 . Natriumdisulfit , rein ( Na2S2O5 )

3.4 . Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung 20 v.H . ( G/V ) p.a .

3.5 . Kaliumhydroxidlösung 25 v.H . ( G/V ) p.a .

3.6 . Oxidationsmischung : 2 ml Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung ( 3.4 ) werden mit 18 ml Kaliumhydroxidlösung ( 3.5 ) gemischt . Diese Mischung hält sich höchstens 4 Std .

3.7 . Isobutanol p.a .

3.8 . 2,5 N Natriumacetatlösung p.a .

3.9 . Multienzympräparat aus Protease , Phosphatase und Amylase ( z.B . " Clarase " )

3.10 . Äthanol 96 v.H . ( V/V ) .

4 . Geräte

4.1 . Wasserbad

4.2 . Zentrifuge ( 3 500 U/Min . ) , dazu eingeschliffene Gläser mit Schliffstopfen , 30 bis 50 ml Inhalt

4.3 . Fluorimeter .

5 . Ausführung

5.1 . Enzymatische Hydrolyse

In zwei 250-ml-Meßkolben A und B werden gleiche Mengen der fein zerkleinerten Probe , die etwa 100 mg Thiamin enthalten , gegeben und 125 ml Schwefelsäure ( 3.2 ) hinzugefügt . In den Kolben A wird ausserdem 1,0 ml der Standardlösung ( 3.1 ) pipettiert ( interner Standard ) .

Die Kolben werden kräftig geschüttelt , 15 Min . lang in einem siedenden Wasserbad unter gelegentlichem Schürteln erwärmt und auf etwa 45 * C abgekühlt . Dann werden jedem Kolben 20 ml Natriumacetatlösung ( 3.8 ) und 0,5 g Multienzympräparat ( 3.9 ) zugesetzt , und es wird 20 Min . lang bei Raumtemperatur stehen gelassen . Man fügt 20 ml Natriumacetatlösung ( 3.8 ) zu , fuellt mit Wasser zur Marke auf und filtriert . Die Filtrate A und B werden aufgefangen , nachdem die ersten 15 ml verworfen wurden . Dann werden die folgenden Lösungen vorbereitet :

5.1.1 . Blindprobenlösung T

5 ml des Filtrats A und ca . 10 mg Natriumdisulfit ( 3.3 ) werden in ein Zentrifugenglas ( 4.2 ) gegeben . Das Glas wird 15 Min . lang in ein siedendes Wasserbad gestellt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt .

5.1.2 . Lösungen A ( interner Standard ) und B ( Probe )

Es werden 5 ml des Filtrats A in ein Zentrifugenglas ( 4.2 ) und 5 ml des Filtrats B in ein anderes Zentrifugenglas ( 4.2 ) gegeben .

5.2 . Oxydation

Den Lösungen T , A und B werden 5 ml Oxydationsmischung ( 3.6 ) und - eine Minute danach - 10 ml Isobutanol ( 3.7 ) zugesetzt . Die Gläser werden verschlossen , 5 Sek . kräftig geschüttelt und nach etwa einer Minute zur Schichtentrennung zentrifugiert . Jedem Zentrifugenglas werden 5 ml der oben schwimmenden Isobutanol-Phase entnommen und in einen 25-ml-Meßkolben pipettiert . Die Kolben werden mit Äthanol ( 3.10 ) zur Marke aufgefuellt und es wird gemischt ( Extrakte T , A und B ) .

5.3 . Messung der Fluoreszenzintensität

Die fluorimetrischen Messungen sind bei der Wellenlänge vorzunehmen , bei der das Gerat für die Thiochromfluoreszenz den grössten Ausschlag zeigt . Die Anregung erfolgt bei 365 nm .

Die Fluoreszenzintensität der Extrakte A und B wird gemessen , indem der Nullwert des Fluorimeters auf die Fluoreszenzintensität des Extrakts T eingestellt wird .

6 . Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Thiamin in mg/kg der Probe wird nach folgender Formel berechnet :

d * b /( a - b ) c

Es bedeuten :

a = Fluoreszenzintensität des Extrakts A ( interner Standard ) ,

b = Fluoreszenzintensität des Extrakts B ( Probe ) ,

c = Gewicht der Analysenprobe in g ,

d = bei der Analysenprobe zugesetzte Thiaminmenge in mg ( interner Standard ) .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe

- bei Gehalten von weniger als 500 ppm Thiamin 10 v.H . relativ und

- bei Gehalten von 500 ppm Thiamin und mehr 5 v.H . relativ

nicht überschreiten .

3 . BESTIMMUNG VON ASCORBINSÄURE UND DEHYDROASCORBINSÄURE ( VITAMIN C )

1 . Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung der Summe von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure ( Vitamin C ) in Futtermitteln , Konzentraten und Vormischungen . Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 5 mg/kg . Je nach dem zu erwartenden Gehalt an Vitamin C sind die Erzeugnisse in zwei Gruppen zu unterteilen :

Gruppe A : Gehalte von weniger als 10 g/kg

Gruppe B : Gehalte von 10 g/kg und mehr .

2 . Prinzip

Die Probe wird in verdünnter Metaphosphorsäure suspendiert und mit Chloroform extrahiert . Die wäßrige Phase wird zur Umwandlung der Ascorbinsäure in Dehydroascorbinsäure mit einer 2,6-Dichlorphenolindophenollösung behandelt und danach mit einer 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung versetzt . Das entstehende Hydrazon wird mit einem Gemisch von Äthylacetat , Eisessig und Aceton extrahiert und der Extrakt über eine Kieselgelsäule chromatographiert . Das Eluat wird zur Trockne verdampft und der Rückstand mit verdünnter Schwefelsäure aufgenommen . Die Extinktion dieser Lösung wird bei 509 nm photometrisch bestimmt .

Bei Erzeugnissen der Gruppe A wird das aus der Chromatographiesäule gewonnene Eluat ausserdem zur Abtrennung des Hydrazons der Dünnschichtchromatographie unterworfen .

3 . Reagenzien

3.1 . L-Ascorbinsäure-Standardlösung 0,05 v.H . : 50 mg L-Ascorbinsäure p.a . werden in ca . 20 ml Metaphosphorsäurelösung ( 3.2 ) gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefuellt . Die Lösung ist kurz vor Gebrauch herzustellen .

3.2 . Metaphosphorsäurelösung 10 v.H . ( G/V ) : 200 g Metaphosphorsäure p.a . , im Mörser zerkleinert , werden in Wasser gelöst und auf 2 000 ml mit Wasser aufgefuellt . Diese Lösung ist bei 4 * C aufzubewahren . Sie ist eine Woche lang haltbar .

3.3 . Chloroform p.a .

3.4 . 2,6-Dichlorphenolindophenollösung 0,5 v.H . ( G/V ) aus 2,6-Dichlorphenolindophenol p.a . Kurz vor Gebrauch herzustellen .

3.5 . Filterflockenmasse ( S . und S . Nr . 121 oder gleichwertiges Material )

3.6 . 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung 2 v.H . ( G/V ) : 2 g 2,4-Dinitrophenylhydrazin p.a . werden in 100 ml verdünnter Schwefelsäure ( 25 ml Schwefelsäure p.a . , D : 1,84 , auf 100 ml mit Wasser aufgefuellt ) gelöst . Im Kühlschrank ist diese Lösung eine Woche lang haltbar .

3.7 . Stickstoff oder

3.8 . Kohlendioxid

3.9 . Gemisch von Äthylacetat p.a./Eisessig p.a./Aceton p.a . : 96/2/2 in Vol .

3.10 . Gemisch von Dichlormethan p.a./Eisessig p.a . : 97/3 in Vol .

3.11 . Kieselgel , granuliert , Teilchengrösse : 0,05 bis 0,2 mm

3.12 . Kieselgel H , nach Stahl , für Dünnschichtchromatographie

3.13 . Verdünnte Schwefelsäure : 105 ml Wasser werden in einem Meßkolben mit Schwefelsäure p.a . , D : 1,84 , auf 200 ml aufgefuellt

3.14 . Laufmittel für Dünnschichtchromatographie : 75 ml Diäthyläther p.a . werden mit 25 ml Äthylacetat p.a . und 4,0 ml Eisessig 96 v.H . ( G/V ) p.a . gemischt . Nach 2 - bis 3maligem Gebrauch frisch zubereiten .

4 . Geräte

4.1 . Ultrathermostat auf 20 * C eingestellt

4.2 . Zentrifuge ( 3 500 U/Min . ) , dazu Gläser mit eingeschliffenem Stopfen , 40 bis 50 ml Inhalt

4.3 . Vakuum-Rotationsverdampfer , mit 250-ml-Rundkolben

4.4 . Chromatographieröhre , aus Glas ( Länge : 100 mm , innerer Durchmesser : 20 mm ) , mit Fritte ( z.B . Allihn'sches Rohr )

4.5 . Spektralphotometer oder Filterphotometer mit 10 mm Kuevetten

4.6 . Apparatur zur Dünnschichtchromatographie , mit Kieselgel(3.12)-Platten , Schichtdicke : 0,5 bis 0,6 mm . ( Fertigplatten können verwendet werden ) . Die Platten werden während 2 1/2 bis 3 Std . im Trockenschrank bei 120 - 130 * C getrocknet und nach dem Abkühlen mindestens 24 Std . vor dem Gebrauch im Exsikkator aufbewahrt .

4.7 . Trockenschrank , auf 120 - 130 * C geregelt .

5 . Ausführung

5.1 . Extraktion

Zwei 250-ml-Meßkolben mit Schliff , A und B , werden mit gleichen Mengen der fein zerkleinerten Probe , die etwa 200 mg Vitamin C enthalten , beschickt . In den Kolben A werden ausserdem 0,4 ml der Standardlösung ( 3.1 ) pipettiert , und es wird durch leichtes Schütteln gemischt ( interner Standard ) . Dann werden bei 4 * C in jeden Kolben 30 ml Chloroform ( 3.3 ) und 25 ml Metaphosphorsäurelösung ( 3.2 ) zugegeben , kurz umgeschüttelt und 10 bis 15 Min . lang stehen gelassen . Nach Zusatz von 25 ml Wasser werden die Kolben verschlossen , 10 Sek . kräftig durchgeschüttelt und 10 bis 15 Min . lang im Ultrathermostat ( 4.1 ) belassen . Anschließend wird zentrifugiert , um die wäßrige Phase von der Chloroform-Phase zu trennen . Die wäßrigen Extrakte A ( interner Standard ) und B werden wie folgt weiterverarbeitet .

5.2 . Oxydation

40 ml der nach 5.1 erhaltenen etwas trüben überstehenden Lösung werden abpipettiert , in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen , das 0,5 bis 1 ml 2,6-Dichlorphenolindophenollösung ( 3.4 ) enthält , übergeführt und gemischt . Die entstehende rote Färbung muß mindestens 15 Min . lang bestehen bleiben . Dann werden ca . 300 mg Filterflockenmasse ( 3.5 ) hinzugefügt , es wird geschüttelt und durch ein trockenes Faltenfilter filtriert . Das Filtrat braucht nicht klar zu sein .

5.3 . Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin und Extraktion des Hydrazons

10 ml des nach 5.2 erhaltenen Filtrats werden abpipettiert , in ein Zentrifugenglas ( 4.2 ) mit 2 ml 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung ( 3.6 ) gegeben und gemischt . Das Glas wird kurz mit Stickstoff ( 3.7 ) oder Kohlendioxid ( 3.8 ) gespült , verschlossen und 15 Std . ( über Nacht ) im Ultrathermostaten ( 4.1 ) belassen . Dann werden 3 ml Wasser , 20 ml des Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemischs ( 3.9 ) und ca . 800 mg Filterflockenmasse ( 3.5 ) zugegeben . Das Glas wird verschlossen , während 30 Sek . kräftig durchgeschüttelt und zentrifugiert . Von der klaren oberen Phase werden 15 ml in einen Kolben pipettiert und am Rotationsverdampfer ( 4.3 ) unter Vakuum eingedampft , bis ein öliger Rückstand verbleibt . Der Rückstand wird mit 2 ml des Äthylacetat/Eissesig/Aceton-Gemischs ( 3.9 ) aufgenommen und bei 50 * C vollständig aufgelöst . Nach dem Abkühlen werden 10 ml des Dichlormethan/Eisessig-Gemischs ( 3.10 ) zugesetzt und es wird gemischt .

5.4 . Säulenchromatographie

Ein Chromatographierohr ( 4.4 ) wird 30 mm hoch mit dem Dichlormethan/Eisessig-Gemisch ( 3.10 ) gefuellt . 5 g Kieselgel ( 3.11 ) werden durch kräftiges Schütteln in 30 ml des Dichlormethan/Eisessig-Gemischs ( 3.10 ) suspendiert und in das Rohr eingegossen . Man lässt absetzen und packt anschließend mit leichtem Stickstoff(3.7)-Druck dichter .

Man gibt die nach 5.3 erhaltene Lösung auf die Säule , spült mit etwas Dichlormethan/Eisessig-Gemisch ( 3.10 ) in die Säule hinein , fuellt das Rohr mit demselben Gemisch ( 3.10 ) auf und wäscht so lange aus ( 3 bis 4 Füllungen von ca . 5 ml ) , bis das Eluat farblos abläuft . Die gelbgefärbte Fraktion des Eluats wird verworfen .

Nun wird der rötliche Säulenkopf mit dem Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemisch ( 3.9 ) eluiert und das erhaltene Eluat zur Trockne eingedampft .

5.4.1 . Bei Erzeugnissen der Gruppe A ( Gehalte an Vitamin C weniger als 10 g/kg ) wird der Rückstand mit 2,0 ml des Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemischs ( 3.9 ) aufgenommen und unmittelbar wie unter 5,5 angegeben auf einer Dünnschichtplatte chromatographiert .

5.4.2 . Bei Erzeugnissen der Gruppe B ( Geholte an Vitamin C von 10 g/kg und mehr ) wird der Rückstand mit 4,0 ml verdünnter Schwefelsäure ( 3.13 ) aufgenommen und bis zur vollständigen Lösung kräftig geschüttelt . Die Extinktion dieser Lösung wird wie unter 5.6 angegeben gemessen .

5.5 . Dünnschichtchromatographie

Das nachfolgende Verfahren wird doppelt ausgeführt . Man trägt 0,5 ml der nach 5.4.1 erhaltenen Lösung auf die Platte ( 4.6 ) auf . Man chromatographiert bei Kammersättigung mit dem Laufminel ( 3.14 ) während mindestens 20 Min . , bis zur guten Abtrennung der rosa gefärbten Zone des Hydrazons , und lässt an der Luft trocknen . Die rosa Zone wird abgegrenzt , mittels eines Spatels abgekratzt und quantitativ in ein Chromatographierohr ( 4.4 ) gebracht .

Man eluiert nacheinander einmal mit 2 ml und dann zweimal mit 1,5 ml des Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemischs ( 3.9 ) und presst in einen kleinen Rundkolben ab ( das letzte Eluat soll farblos sein ) . Man dampft bis zur Trockne , nimmt den öligen Rückstand in 4,0 ml verdünnte Schwefelsäure ( 3.13 ) auf , schüttelt kräftig durch , um den Rückstand vollständig aufzulösen , und misst wie folgt die Extinktion .

5.6 . Messung der Extinktion

Die Extinktion wird 20 bis 30 Min . nach Zugabe der Schwefelsäure bei 509 nm photometrisch bestimmt . Die Messungen werden im Vergleich mit verdünnter Schwefelsäure ( 3.13 ) ausgeführt .

5.7 . Blindversuch

Ein Blindversuch wird unter den gleichen Bedingungen ohne Probe durchgeführt .

6 . Berechnung der Ergebnisse

Der Gehalt an Vitamin C der Probe in g/kg wird nach folgender Formel berechnet :

( c - a ) * 2

( b - c ) * 10d

wobei :

a = Extinktion des Blindwerts ,

b = Extinktion der internen Standardlösung ,

c = Extinktion der Probelösung ,

d = Gewicht der Analysenprobe ing .

Wiederholbarkeit

Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und derselben Probe

- bei Gehalten von weniger als 10 g Vitamin C pro kg 10 v.H . relativ und

- bei Gehalten von 10 g Vitamin C pro kg und mehr 5 v.H . relativ

nicht überschreiten .

( 1 ) 1 IE = 0,3 mg Retinol .

( 2 ) Bei Milchaustauschfutter oder bei anderen zur Klumpenbildung oder Quellung neigenden Erzeugnissen sind die unter 5.2 erster und zweiter Absatz aufgeführten Reagenzienmengen zu verdoppeln .

( 3 ) Der Zusatz von Natriumascorbat kann unterbleiben , wenn die Hydrolyse unter Stichstoff-Atmosphare erfolgt .

( 4 ) Der Carotingehalt kann durch Extinktionsermittlung bei 450 nm bestimmt werden E 1 % /1 cm = 2 600 .